高壓蒸汽滅菌后，正確的操作步驟至關重要。在打開排氣閥前，必須確保壓力已降至零，這是為了防止內部的培養基因內外壓力差異而發生復沸騰，可能導致液體溢出或棉塞沾濕，引發安全事故。當壓力降到0.05MPa時，可以開始緩慢放氣，此時再進行開蓋取物，以防止培養基在溫度降低過程中發生成分變化，影響后續的實驗操作。

在操作過程中需要注意以下幾點：首先，包裹物的大小和緊密程度應適宜，一般小于30cm×30cm×50cm，避免阻礙蒸汽的流通。其次，包裹不宜排得太密，以確保滅菌效果。壓力、溫度和時間達到設定標準后，指示帶和化學指示劑會顯示滅菌已完成。對于易燃易爆物品，如碘仿、苯類，應避免使用高壓蒸汽滅菌。此外，銳利的器械如刀、剪也不宜用此法，以免變鈍。在瓶裝液體滅菌時，需用玻璃紙和紗布包裹瓶口，并在必要時插入針頭排氣。操作過程中應由專人負責，定期檢查安全閥，確保設備安全運行。每次滅菌后，要記錄日期并注明保存時限，一般為1-2周。