退火溫度在PCR反應中扮演著關鍵角色，它直接影響著反應的特異性。主要受到引物的長度、堿基組成和濃度的影響。引物越短，G+C含量越低，所需的退火溫度就越低，但過低可能導致非特異性擴增增加。提高退火溫度雖然提高特異性，但可能降低擴增效率。退火溫度通常通過Tm公式估算，然后減去5℃以優化反應設計。

PCR的基本原理是利用DNA的變性復性過程，通過DNA聚合酶在特定溫度下的作用進行擴增。PCR儀作為溫控設備，能夠精確控制變性、復性和延伸溫度。PCR的強大之處在于能以極小的DNA樣本進行大量復制，對于法醫學等領域中的“微量證據”分析尤其重要。

PCR技術自1985年Mullis發明以來，經歷了多次迭代。中國科學家錢嘉韻的發現對這一技術的發展也起到了基礎性作用。在實際應用中，引物退火溫度的確定需要綜合考慮引物的Tm值，通常在預估的Tm值基礎上適當降低，以保證最佳的特異性。延伸步驟一般在72℃進行，但具體時間根據擴增片段的長度進行調整。

總的來說，退火溫度是PCR反應中一個需要精細調節的關鍵參數，它在特異性和擴增效率之間找到平衡，對于PCR技術的成功至關重要。