三羧酸循環（TCA）是一種酶促反應循環系統，用于將乙酰CoA中的乙酰基氧化成CO2。循環始于乙酰CoA與草酰乙酸縮合形成檸檬酸。檸檬酸合成酶催化的反應是關鍵步驟，此酶需要草酰乙酸的供應以維持循環的順利進行。檸檬酸合酶首先使乙酰CoA的甲基上失去一個H+，生成的碳陰離子對草酰乙酸的羰基碳進行親核攻擊，生成檸檬酰CoA中間體，然后高能硫酯鍵水解放出游離的檸檬酸，使反應不可逆地向右進行。此反應由檸檬酸合成酶催化，是很強的放能反應。檸檬酸合酶是一個變構酶，ATP、α-酮戊二酸、NADH能變構抑制其活性，長鏈脂酰CoA也可抑制其活性，AMP可對抗ATP的抑制而起激活作用。異檸檬酸轉變為異檸檬酸時，由順烏頭酸酶催化，為一可逆反應。異檸檬酸的仲醇氧化成羰基，生成草酰琥珀酸的中間產物，后者在同一酶表面，快速脫羧生成α-酮戊二酸、NADH和CO2，此反應為β-氧化脫羧，此酶需要Mg2+作為激活劑。α-酮戊二酸脫氫酶系催化α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰CoA、NADH·H+和CO2，反應過程完全類似于丙酮酸脫氫酶系催化的氧化脫羧，屬于α-氧化脫羧，氧化產生的能量中一部分儲存于琥珀酰CoA的高能硫酯鍵中。琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸氧化成為延胡索酸，此酶結合在線粒體內膜上，而其他三羧酸循環的酶則都是存在線粒體基質中的。丙二酸是琥珀酸的類似物，是琥珀酸脫氫酶強有力的競爭性抑制物。延胡索酸酶僅對延胡索酸的反式雙鍵起作用，而對順丁烯二酸則無催化作用，因而是高度立體特異性的。在蘋果酸脫氫酶作用下，蘋果酸仲醇基脫氫氧化成羰基，生成草酰乙酸，NAD+是脫氫酶的輔酶，接受氫成為NADH·H+。三羧酸循環總結：乙酰CoA+3NAD++FAD+GDP+Pi—→2CO2+3NADH+FADH2+GTP+2H++CoA-SH。CO2的生成，循環中有兩次脫羧基反應，兩次都同時有脫氫作用，但作用的機理不同。三羧酸循環的四次脫氫，其中三對氫原子以NAD+為受氫體，一對以FAD為受氫體，分別還原生成NADH+H+和FADH2。它們又經線粒體內遞氫體系傳遞，最終與氧結合生成水，在此過程中釋放的能量使ADP和Pi結合生成ATP。乙酰CoA中乙酰基的碳原子，乙酰CoA進入循環，與四碳受體分子草酰乙酸縮合，生成六碳的檸檬酸，在三羧酸循環中有二次脫羧生成2分子CO2，與進入循環的二碳乙酰基的碳原子數相等，但是，以CO2方式失去的碳并非來自乙酰基的兩個碳原子，而是來自草酰乙酸。三羧酸循環的中間產物，從理論上講，可以循環不消耗，但是由于循環中的某些組成成分還可參與合成其他物質，而其他物質也可不斷通過多種途徑而生成中間產物，所以說三羧酸循環組成成分處于不斷更新之中。