1、畢氏酵母氯化鋰轉(zhuǎn)化法(1) 試劑- 使用去離子蒸餾水配制1M LiCl，并通過濾膜過濾除菌。必要時，可用消毒去離子水稀釋。- 50% PEG3350（Sigma P3640）配制時，也需通過濾膜過濾除菌，并使用緊蓋瓶分裝。- 2mg/ml鮭魚精DNA/TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）應(yīng)在-20℃保存。(2) 感受態(tài)畢氏酵母的制備- 在50ml YPD培養(yǎng)基中接種Pachia pastoris，30℃搖菌過夜，直至OD值為0.8～1.0（約10^8 Cells/ml）。- 收獲細(xì)胞后，用25ml無菌水洗滌一次，室溫下1500g離心10min。- 重懸細(xì)胞于1ml 100mM LiCl溶液中，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管。- 離心機(jī)最大速度離心15秒沉淀菌體，隨后重懸菌體于400ul 100mM LiCl溶液中。- 按50ul/管分裝，立即進(jìn)行轉(zhuǎn)化。(3) 畢氏酵母的轉(zhuǎn)化- 煮沸1ml鮭魚精DNA 5min，然后迅速冰浴以制備單鏈擔(dān)體DNA。- 離心去除感受態(tài)酵母菌的殘余LiCl溶液。- 轉(zhuǎn)化時，按順序加入50% PEG3350、1M LiCl、2mg/ml 單鏈Salmon sperm DNA和質(zhì)粒DNA。- 劇烈旋渦混勻直至沉淀菌體完全分布均勻。- 30℃水浴孵育30min；42℃水浴熱休克20～25min。- 6000～8000rpm離心收集酵母菌體；重懸酵母于1ml YPD培養(yǎng)基，30℃搖床孵育。- 1～4h后，取25～100ul菌液鋪選擇性培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)2～3天以鑒定。2、畢氏酵母PEG1000轉(zhuǎn)化法(1) 試劑- 緩沖液A（1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35）、緩沖液B（40% PEG1000，0.2M Bicine，pH8.35）和緩沖液C（0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35）均通過濾膜過濾，并在-20℃保存。- 試劑級DMSO應(yīng)-70℃保存。(2) 待轉(zhuǎn)化畢氏酵母的制備- 從YPD平板上挑取單克隆酵母菌株，于10ml YPD培養(yǎng)基中30℃振蕩培養(yǎng)過夜。- 取適量菌液接種到100ml YPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，直至OD值達(dá)到0.5～0.8。- 室溫下3000g離心收集酵母菌體，用50ml緩沖液A洗滌一次。- 重懸菌體于4ml緩沖液A中，按0.2ml/管分裝于1.5ml離心管中，每管加入11ul DMSO，混合后迅速于液氮中冷凍，-70℃保存。(3) 畢氏酵母的轉(zhuǎn)化- 將約50ug線性化質(zhì)粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于凍結(jié)的酵母細(xì)胞中。加入擔(dān)體DNA以獲得最大轉(zhuǎn)化率。- 37℃水浴孵育5min，中間混合樣品1～2次。- 取出離心管，加入1.5ml緩沖液B，徹底混勻。- 30℃水浴孵育1h。- 室溫下2000g離心10min，去除上清液，菌體沉淀重懸于1.5ml緩沖液C中。- 再次離心去除上清液，輕微操作將樣品重懸于0.2ml緩沖液C中。- 將所有轉(zhuǎn)化液鋪于選擇性平板，30℃孵育3～4天后，鑒定。3、畢氏酵母電轉(zhuǎn)化法(1) E.coli TOP10F’感受態(tài)細(xì)胞的制備- 從200ml LB液體培養(yǎng)基中活化的TOP10F’菌液中取10ul，接種于滅菌的500ml離心管中，37℃，200 rpm，培養(yǎng)16～18小時。- 取100ul菌液接種于200ml液體LB培養(yǎng)基中，37℃，200 rpm，繼續(xù)培養(yǎng)16～18小時。- 滅菌后，4℃、4000 rpm離心20min，收集菌體沉淀，棄上清，用10%甘油重懸并洗滌，重復(fù)洗滌3次。- 第三次離心后，棄去絕大部分上清，留下約1ml液體用于重懸菌體。- 從制得的感受態(tài)細(xì)胞中，取200ul于滅菌EP管中，加入連接反應(yīng)產(chǎn)物5ul，混勻，不要產(chǎn)生氣泡，在冰上放置5min。- 將混勻后的200ul菌液移入電擊杯中。- 使用電擊穿孔儀進(jìn)行轉(zhuǎn)化，設(shè)置為電壓2500V，時間5ms。- 電擊后，加入800ul SOC培養(yǎng)基沖洗出菌體，轉(zhuǎn)移至滅菌1.5ml EP管中，37℃，150 rpm，輕搖45～60min。- 取全部菌液均勻涂布于含Zeocin 25ug/ml的LLB-Zeocin平板上，正放，待涂布液不在流動，37℃培養(yǎng)12～16小時。(2) 線性化質(zhì)粒DNA對Pichia pastoris GS115的轉(zhuǎn)化- 從-70℃中取出的新鮮或保存的感受態(tài)細(xì)胞，在冰浴中完全解凍。- 將100μl菌體移至一新的無菌Eppendorf管中，加入5-20μg線性化質(zhì)粒（5～10μl），輕彈混勻，然后轉(zhuǎn)移至0.2cm型的電穿孔轉(zhuǎn)化杯中。- 轉(zhuǎn)化杯置于冰浴中5～10分鐘，保持低溫。- 電穿孔轉(zhuǎn)化電擊條件：電壓1500V；電阻400Ω；電容25μF；脈沖時間10mS；一次電擊。- 電擊后，馬上在電擊轉(zhuǎn)化杯中加入1ml 4℃預(yù)冷的1M的山梨醇溶液，用微量移液槍吹打均勻，置于冰浴中。- 取30℃烘至表面半干的MD培養(yǎng)基平板，在超凈工作臺上無菌操作涂布平板，400μl/板。詳情