黑色素瘤的鑒別診斷包括基底細胞癌、脂溢性角化癥、發育不良痣、藍痣、皮膚纖維瘤、各種類型的痣、血管瘤（特別是手和足）、靜脈湖、化膿性肉芽腫和疣。對于存在疑問的病損，應進行全層皮膚活檢，對于較小的病損，可施行切除活檢，較大的病損則需要切開活檢。連續切片活檢有助于確定黑素瘤的浸潤深度，從而指導徹底的根治性手術的實施。對于色素性損害，應考慮切除或活檢的標準包括病損近期增大、變黑、出血或潰瘍。這些癥狀通常意味著黑素瘤可能已侵入皮膚深層。當皮損出現顏色改變（如褐色或黑色混有紅、白或藍色背景），或可見到或能觸及的不規則隆起、邊緣呈角形鋸齒或有切跡時，應立即進行活檢以作出早期診斷。使用皮膚鏡檢查有助于區分黑素瘤和良性病損。組織學判斷治療和預后主要依據顯微鏡下觀測黑素瘤組織學上的浸潤深度。組織學分級需要進行充分的活檢，但中樞神經系統和甲床下黑素瘤通常不采用這些系統進行分類。淋巴細胞的浸潤深度反映了患者的免疫應答系統，與浸潤程度及預后密切相關。如果淋巴細胞僅在大多數表淺病損中浸潤，則治愈的機會較大；反之，隨著浸潤深度的增加，治愈的機會明顯下降。