熒光共振能量傳遞（FRET）是指熒光標記基團在激發光刺激下生成特定波長的發射光，當另一屏蔽基團與其距離合適時，原發射光會被屏蔽基團吸收并轉化為其他波長的發射光或熱能。這種現象在熒光定量PCR中得到廣泛應用。熒光定量PCR使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料。在PCR擴增過程中，會加入一對引物和一個特異性的熒光探針。探針通常是一段寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。當探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；但在PCR擴增過程中，Taq酶的5’-3’外切酶活性會將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就會有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。在熒光定量PCR技術中，靶基因的確定和引物及探針的設計遵循一定的原則。選擇檢測組共有的基因以避免檢測的假陰性；選擇檢測組內的保守序列（突變少）和組間特異的序列（突變多）作為引物和探針的設計位置，片段長度應在70-150bp之間。引物的長度應為17-25bp，GC含量應在30-80%，退火溫度（Tm值）應在58-60℃之間。避免穩定的引物二聚體及發夾結構（自由能大于-3.5kc/m），序列中不能出現連續的G，3’端避免G或C，最后5個堿基內避免兩個以上的G或C。探針的長度應為20-30bp（Taqman）或16-25bp（MGB），GC含量應在30-80%，Tm值應為68-70℃。避免穩定的二聚體及發夾結構（自由能大于-3.5kc/m），5’端不能是G，位置盡量靠近上游引物。選擇波長差異較大（多聯檢測）或Fam（單聯檢測）的熒光標記。實時熒光定量PCR具有特異性強、靈敏度高、避免污染、實現定量、高效低耗、操作簡便和快速的特點。通過標準品獲得標準曲線，結合Ct值進行準確定量。反應時間小于1.5小時。熒光定量PCR技術在提高檢測效率、縮短檢測周期、提高通關速度和降低檢測成本、提高經濟與社會效益方面具有重要實用意義。詳情