1. 免疫組化技術是分子生物學中不可或缺的技術之一，它通過免疫學原理揭示組織切片中的大分子物質定位和含量。2. 免疫組化的核心原理包括酶標記、熒光和膠體金等。為了有效解決實驗中常見的問題，如無染色、高背景和非特異性染色，需要精確匹配試劑、優化孵育條件以及改進預處理工藝。3. 取材與固定是免疫組化實驗的基礎步驟，必須選擇適當的材料并確保固定液的溫度控制在37℃過夜或60℃ 1-2小時，以防止樣本脫落。4. 脫蠟過程需要耐心，使用二甲苯分三次處理，每次10分鐘，然后逐漸降至70%酒精。內源性過氧化酶的抑制是關鍵步驟，通常使用3%H2O2處理，同時用0.5%高碘酸處理氣泡。5. 抗原修復是確保目標蛋白有效暴露的重要步驟，可以選擇酶、高壓熱或微波熱修復，使用檸檬酸鹽或EDTA修復液。6. 封閉步驟非常關鍵，通常使用5%BSA或血清，確保一抗與二抗的同源性匹配。一抗的孵育溫度根據抗體類型選擇4℃或37℃，二抗與SABC孵育時間為37℃ 30分鐘。7. 顯色過程選擇DAB，現用現配，嚴格控制反應時間以保證結果的準確性。復染與返藍使用Mayer蘇木素、堿性溶液和DAPI染核，增強樣本對比度。8. 脫水透明化處理中，使用二甲苯兩次，封片時選擇中性樹膠，結合抗熒光衰減或水溶性封片，保護樣本。9. 對照實驗是確保實驗可靠性的關鍵，必須包括陽性、陰性和空白對照，以驗證實驗結果和試劑性能。10. 對照實驗可以幫助觀察蛋白在不同區域的表達，如CA家族抗原、MCA、CR在細胞質-膜型的表達，或S-100、HMB45等在細胞核-質型的定位。11. 量化分析是提高實驗精確度的關鍵，可以通過40倍光鏡下計數陽性著色細胞的比率，或利用ImageJ進行灰密度分析，確保結果的準確性。12. 評分法結合染色程度和陽性范圍，為實驗結果賦予量化標準。若想了解更多關于IHC的問題與技巧，可以參考《IHC/IF實驗課堂》直播課，由博士德專家為您揭開實驗背后的科學秘密。這是一份全面且詳盡的IHC實驗指南，助您從新手到專家，步步為營，解鎖免疫組化的無限可能。