脊索動物門與脊椎動物亞門的主要區別在于形態特征和生活習性。脊索動物門的特征在于其位于消化道和神經管之間的脊索，這一結構為它們提供了支持。在脊索動物的胚胎期，所有物種都具有脊索，但隨后的生活階段中，這一結構可能得以保留（如尾索動物亞門、頭索動物亞門），或者退化并被脊柱所取代。脊椎動物亞門的物種則具有明顯的頭部結構，其中樞神經系統形成管狀，前端擴展為腦，后方則為脊髓。在這些動物中，除了圓口綱、軟骨魚綱和硬骨魚綱外，大多數物種的脊索在發育早期后便被脊椎骨構成的脊柱所替代。生活習性上，脊索動物門中的柄海鞘成體呈長橢圓形，幼體則類似蝌蚪。它們通過柄附著在海底或被海水淹沒的物體上，并通過頂端的入水孔進行攝食。而脊椎動物亞門的物種，原生水生動物通過鰓進行呼吸，而次生水生動物和陸棲動物則主要在胚胎期使用鰓裂，成體則轉換為肺呼吸。除了圓口綱外，這些動物都具有上頜和下頜。它們的循環系統更為完善，具有能夠收縮的心臟，以促進血液循環。此外，它們還擁有復雜的腎臟，用于更有效地排除新陳代謝產生的廢物。在下屬物種方面，脊索動物門涵蓋了尾索動物亞門、頭索動物亞門和脊椎動物亞門。而脊椎動物亞門則包括圓口綱、軟骨魚綱、硬骨魚綱、兩棲綱、爬行綱、鳥綱和哺乳綱。