1. 在設(shè)計PCR引物時，應(yīng)確保引物自身及其之間的序列不具有互補性，以避免形成雙鏈或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。同時，引物的5'端應(yīng)具有較高的G+C含量，3'端則應(yīng)較低，以增強穩(wěn)定性。引物的5'端可以進行化學修飾，而3'端則不行，以保持末端的序列特異性。此外，擴增產(chǎn)物不應(yīng)存在二級結(jié)構(gòu)，以確保擴增的準確性。2. 引物設(shè)計時還需注意以下幾點：引物內(nèi)部不應(yīng)有互補序列，以免形成雙鏈結(jié)構(gòu)；兩個引物之間也不應(yīng)互補重疊，特別是3'端，以防止非特異性結(jié)合。3. 遵循PCR引物設(shè)計的11條黃金法則，包括在模板cDNA的保守區(qū)域設(shè)計引物，這通常是通過比較不同物種間的相似序列來確定的。4. 引物的長度一般應(yīng)在15至30個核苷酸之間，有效長度（計算公式為Ln=2(G+C)+(A+T)）應(yīng)小于38，以免PCR最適延伸溫度過高，超出Taq酶的最佳工作溫度，降低產(chǎn)物的特異性。5. PCR引物設(shè)計的根本目的是選擇一對適當?shù)暮塑账崞危员阌行U增模板DNA序列。引物的質(zhì)量直接影響PCR的特異性和成功率。6. 引物設(shè)計遵循三條基本原則：引物與模板DNA序列緊密互補，引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，且引物不應(yīng)在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng)，即避免錯配。