無菌手套的使用過程中，必須確保手套的內外面區分準確。在接觸無菌手套時，只能觸摸手套的內部，避免污染。在使用無菌手套前，應先進行手部清潔，并仔細核對手套包裝上的號碼與滅菌日期是否正確。打開手套包裝后，需使用滑石粉潤滑手套。一只手掀起手套包裝的外層，另一只手捏住手套翻折部分，即手套內面，從中取出手套。將取出的手套對準手指戴上。同樣的方法，掀起另一手套包裝，用已戴手套的手指插入另一手套翻邊內，取出另一只手套戴上。之后，雙手調整手套位置，確保手套能夠完全覆蓋住工作服的衣袖外側。在戴手套的過程中，應注意未戴手套的手不可觸及手套外部，而戴手套的手則不可觸及未戴手套的手或另一手套的內部。如發現手套有任何破損，應立即更換新的手套。脫手套時，應將手套的邊緣翻轉向下，避免用力拉扯手套的邊緣或手指部分，以免造成手套破損。在脫手套時，已戴手套的手不可觸及手套內部或未戴手套的手。若在使用過程中發現手套有任何破損，必須立即更換新的手套，以確保無菌操作的安全性。