蛋白質分離純化的一般程序通常分為四個步驟。首先，材料的預處理及細胞破碎。這個階段的目標是將蛋白質從組織或細胞中釋放出來，同時保持其天然狀態和活性。因此，需要采用適當的方法將組織和細胞破碎。常見的破碎方法包括機械破碎法、滲透破碎法、反復凍融法、超聲波法和酶法。機械破碎法利用機械力剪切作用實現細胞破碎，常用的設備有高速組織搗碎機、勻漿器和研缽。滲透破碎法則是在低滲條件下使細胞溶脹而破碎。反復凍融法則通過細胞內液結冰膨脹使細胞脹破，但需注意溫度敏感的蛋白質不宜采用此法。超聲波法則通過超聲波震蕩器使細胞膜張力不均實現細胞破碎。酶法則如溶菌酶破壞微生物細胞。接下來是蛋白質的抽提。選擇適當的緩沖液溶劑將蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度和成分等條件的選擇需根據欲制備的蛋白質的性質來定。例如，膜蛋白的抽提通常需要加入表面活性劑（如十二烷基磺酸鈉和Triton X-100），以破壞膜結構，利于蛋白質與膜的分離。在抽提過程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌，以防止蛋白質變性。第三步是獲得蛋白質粗制品。選擇適當的方法將所需的蛋白質與雜蛋白分離。常用的分離方法是根據蛋白質溶解度的差異。等電點沉淀法基于不同蛋白質的等電點不同，通過調節pH使它們相互沉淀分離。鹽析法則根據不同蛋白質鹽析所需的飽和度不同，通過調節鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀的蛋白質仍保持天然性質，并能在低溫下再度溶解而不變性。有機溶劑沉淀法則利用中性有機溶劑（如乙醇和丙酮）降低球狀蛋白質在水中的溶解度，促使它們從溶液中沉淀。有機溶劑破壞蛋白質表面水化層，使蛋白質分子變得不穩定而析出，但需注意有機溶劑會變性蛋白質，因此在低溫下操作并選擇合適的有機溶劑濃度。最后一步是對樣品進行進一步分離純化。等電點沉淀法和鹽析法得到的蛋白質通常含有其他蛋白質雜質，需進一步純化以獲得較高純度的樣品。常用的純化方法包括凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析和親和層析。有時，這些方法需要聯合使用才能得到高純度的蛋白質樣品。